缺血缺氧条件下丁苯酞促进人脐静脉内皮细胞形成血管的体外实验及机制研究

摘要：目的 探索体外缺血缺氧条件下丁苯酞促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成血管及其与血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体2(VEGF/VEGFR2)-Notch1/Dll4信号的相关性.方法 对HUVEC传代培养后设置对照组、模型组、丁苯酞干预组(高剂量组和低剂量组),调整细胞浓度为1×105个/ml,每组从均匀的细胞悬液中直接加入1 ml(即每组细胞1×105个),模型组和丁苯酞干预组均为缺血缺氧条件下培养的HUVEC,丁苯酞高、低剂量组使用含有终浓度分别为20μmol/L和5μmol/L的丁苯酞培养基进行培养.采用细胞增殖活性检测法检测各组细胞的细胞活力,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力,体外血管形成实验检测各组细胞的成管能力,蛋白质印迹法检测受体蛋白VEGFR2、Notch1和配体Dll4的表达水平,ELISA法检测培养基中VEGF的表达水平,实时荧光定量PCR检测VEGF、VEGFR2、Notch1、Dll4的mRNA表达水平.结果 丁苯酞可以提高缺血缺氧条件下HUVEC的存活率,低剂量组和高剂量组在培养6、12、24、48 h过程中,细胞存活率为78.6％±3.0％、59.6％ ±5.3％、44.6％ ±4.2％、38.2％ ±4.3％和88.6％ ±6.3％、67.5％ ±5.4％、53.3％±4.2％、46.3％ ±3.9％,与模型组比较差异均有统计学意义(75.2％ ±5.8％、53.2％±4.8％、36.2％ ±7.8％,22.5％ ±4.1％;t=4.513、6.231、9.322、9.674,P=0.021、0.018、0.026、0.015;t=8.123、11.211、12.312、14.154,P=0.001、0.002、0.001、0.001).细胞迁移实验中丁苯酞低剂量组和高剂量组的细胞迁移能力分别为52.3％ ±4.2％和87.5％ ±5.2％,较模型组(18.5％±3.2％)及对照组(22.3％±4.1％)均明显升高(t=18.324、15.183,P=0.000、0.000;t=22.142、19.341,P=0.000、0.000).蛋白检测中,丁苯酞低剂量组和高剂量组VEGFR2、Notch1以及Dll4的相对表达量为1.12±0.17、0.35±0.07、0.42±0.08和1.30±0.15、0.41±0.10、0.48±0.11,相比模型组(0.82±0.05、0.30±0.03、0.32±0.04)明显升高(t=6.120、2.123、4.112,P=0.000、0.020、0.003;t=8.122、3.851、5.130,P=0.000、0.000、0.001).丁苯酞低剂量组和高剂量组中VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达水平分别为0.43±0.08、0.41±0.05、0.38±0.03、0.36±0.04和0.58±0.05、0.50±0.06、0.41±0.05、0.52±0.06,相比模型组(0.28±0.03、0.34±0.04、0.27±0.03、0.19±0.04)差异均具有统计学意义(t=3.122、3.825、4.311、5.211,P=0.000、0.006、0.001、0.000;t=4.225、4.872、5.311、8.220,P=0.000、0.000、0.000、0.000).结论 丁苯酞可以在体外缺血缺氧条件下促进HUVEC形成血管,其机制可能与VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信号的激活有关,这可能是丁苯酞改善急性缺血性卒中脑微循环的机制之一.