褪黑素对脑缺血再灌注大鼠神经干细胞增殖的影响及机制研究

摘要：目的 探讨褪黑素对缺血再灌注(IR)大鼠脑内神经干细胞(NSCs)增殖的影响及其相关机制.方法 将72只大鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组(n=12)、模型组(n=30)及褪黑素组(n=30),根据IR后的时间分别将模型组与褪黑素组大鼠分为6 h、24 h、72 h和7 d 4个亚组.通过HE染色法观察褪黑素对IR大鼠损伤侧室管膜下区(SVZ)细胞损伤的影响,采用增殖细胞核抗原(PCNA)/巢蛋白(Nestin)免疫荧光双标法观察褪黑素对损伤侧SVZ内源性NSCs增殖的影响,通过免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测褪黑素对损伤侧SVZ Toll样受体4(TLR4)及核转录因子(NF)-κB p65蛋白表达的影响.通过一般线性回归分析褪黑素组与模型组PCNA+Nestin+DAPI+细胞数差值与TLR4+、NF-κB p65+细胞数差值之间的相关性.结果 HE染色显示模型组大鼠损伤侧SVZ细胞排列紊乱,形态不规则;褪黑素组大鼠损伤侧SVZ细胞排列较整齐,形态较规则.免疫荧光双标染色显示模型组(498.47±26.44/mm2)与褪黑素组(623.10±39.70/mm2)大鼠各时间点损伤侧SVZ PCNA+Nestin+DAPI+细胞数逐渐增加,IR后7 d达较高水平,均显著高于正常对照组(203.91±32.23/mm2)(F=35.193、170.344、277.536、285.947,均P＜0.01),褪黑素组大鼠PCNA+Nestin+DAPI+细胞数均显著高于模型组(F=102.561、91.244、168.502、38.013,均P＜0.01).免疫组织化学染色显示模型组(740.02±31.63/mm2;710.01±26.59/mm2)和褪黑素组(555.57±25.28/mm2;528.85±30.60/mm2)大鼠各时间点损伤侧SVZ TLR4+与NF-κB p65+细胞数逐渐增多,IR后7 d达较高水平,且均显著多于正常对照组(F=21.413、263.059、873.691、1037.098,均P＜0.01;F=26.374、372.940、854.826、929.018,均P＜0.01),褪黑素组TLR4+与NF-κB p65+细胞数均较模型组显著下降(F=7.641、25.135、66.094、103.753;F=18.612、69.597、113.113、119.814;均P＜0.05).蛋白质印迹结果显示建模后7 d,模型组和褪黑素组大鼠TLR4(0.87± 0.08,0.68±0.06)与NF-κB p65(0.72±0.05,0.58±0.05)蛋白相对表达量显著高于正常对照组(0.35± 0.04,0.31±0.03;F=107.43,F=132.51,均P＜0.01),褪黑素组TLR4与NF-κB p65蛋白表达量均较模型组显著下降(均P＜0.01).一般线性回归显示建模后各时间点褪黑素组与模型组的PCNA+Nestin+DAPI+细胞数差值与TLR4+、NF-κB p65+细胞数差值均呈负相关(r2=0.838,r2=0.813,均P＜0.01).结论 褪黑素可抑制TLR4、NF-κB p65蛋白的表达,促进IR大鼠脑内源性NSCs的增殖.